Así, con ocho años, sus padres se trasladan a Florencia, mientras Galileo permanece en Pisa al cuidado de Muzio Tedaldi, pariente por parte materna. No obstante, a los diez años se reúne con sus padres, quienes confían su educación a Jacopo Borghini. Este lo inscribió pocos años después en el Monasterio camalfolense de Vallombrasa, donde profesa como novicio. Su padre, instado por la tradición de sus ancestros (el nombre de Galileo le fue impuesto al pisano en recuerdo de uno de sus antepasados, médico de gran prestigio), le envía de nuevo con Tedaldi, quien lo matricula en 1581 en la carrera de medicina en la Universidad de Pisa.

En contra de los anhelos paternos, Galileo se interesa intensamente en las enseñanzas que recibe de Filippo Fantoni, titular de la cátedra de Matemáticas en dicha universidad; enseñanzas que absorben por entero sus estudios durante sus vacaciones en Florencia. Por lo demás, los cursos que impartiera Ostilio Ricci entre 1582 y 1583 sobre los "Elementos" de Euclides, decantan por entero la vocación de Galileo, y, en 1585, abandona sus estudios de medicina sin completar su graduación, centrándose por completo en el estudio de los textos de Euclides y Arquímides, que Ricci había heredado de su mentor Tartaglia, traductor de numerosos tratados grecolatinos.
Comparece por primera vez la tenacidad del pisano, que insiste con denuedo en afianzar su empeño, enfrentando las reticencias y recelos paternos. Ya en 1585-86 se encuentra enseñando matemáticas en Siena, donde escribe su primer libro "La Balancitta", sobre las propiedades y fundamentos de las balanzas. Tras su primer viaje a Roma, donde visita a Clavius, profesor del Colegio Romano de los jesuitas, consigue una plaza en Bolonia (en buena medida por intersección del erudito romano). A partir de entonces, Clavius y Guidobaldo del Monte se convierten en sus mentores, confidentes y amigos, con quienes intercambia numerosa correspondencia y debate sobre sus hallazgos sobre el cálculo del centro de gravedad de los cuerpos. La actividad de Galileo en estos años es frenética, ocupando varios puestos de prestigio en las universidades toscanas y vénetas. En 1589, enseña en Pisa, sucediendo a Fantoni en la cátedra de Matemáticas. Durante su estancia en la ciudad toscana escribe "De Motu", conjunto de ensayos sobre la teoría del movimiento, que nunca llegó a publicar. Sin embargo, los avatares familiares ensombrecen la progresión del inicio de su carrera. En 1591 muere su padre, y Galileo con su sueldo de 60 escudos anuales debe afrontar el sustento de su familia; y, en particular, se ve instado a sufragar los dispendios de las dotes matrimoniales de sus dos hermanas.

Galileo recurre a Del monte, quien lo propone como profesor en la universidad de Padua, en los dominios de la República independiente de Venecia, cobrando un salario tres veces superior del que percibía en Pisa (320 florines anuales). En Padua, transcurre los dieciocho mejores años de su vida, en un ambiente alejado de la férrea censura pontificia, como instructor en la Universidad que años antes acogiera como alumno a Copérnico y ajeno a las penurias económicas precedentes. De nuevo le sonríe la vida y entabla una relación estable con Maria Gamba, con quien no llegaría a formalizar matrimonio, aunque contaron con descendencia: Virginia, nacida en 1600; Livia, en 1601 y Vincenzo en 1606. En esta época Galileo reconoce haber cometido un error relativo a su concepción de la entidad de la gravedad, tras consultar a Paolo Sarpi, matemático asesor del gobierno veneciano, se esfuerza en enmendar el contenido vertido en "De motu...", y comienza a trabajar en 1604 en el movimiento de los cuerpos que se deslizan por planos inclinados y en la ley del péndulo.

De 1609 data la construcción de su telescopio, que irá perfeccionando con perseverancia, basándose en la concordancia de dos lentes de concavidades contrapuestas. Sus observaciones con estos instrumentos (réplicas mejoradas del ideado por Thomas Harriot) le permite obtener numeroso resultados, desconocidos en esos años. En particular, descubre las irregularidades de la Luna, intuye y demuestra la presencia de satélites en Júpiter y anillos en Saturno, consigue explicar las fases de Venus y la composición estelar de la Vía Láctea, apunta la existencia del movimiento de libración selénico, etc.; un cúmulo de novedosos aspectos astronómicos, que, en parte, recopiló en 1610 en "El Mensajero de las estrellas", y que fuera completando en aportaciones posteriores.

El éxito alcanzado por "El Mensajero..." incrementó el prestigio del pisano, que, en junio de 1610, le lleva a ocupar el máximo rango de profesor en la Universidad de Pisa y a encargarse personalmente del cargo de "Matemático y Filósofo" personal del Gran Duque de Toscana: Cosme II de Médicis. Viaja a Roma en 1611, donde se le recibe con todo tipo de honores, encumbrado por los astrónomos pontificios, y, en particular, por el papa Pablo IV, que no le permite arrodillarse ante su presencia. También se interesa por él el gran defensor de la contrareforma, el cardenal Belarmino, quien solicita de Clavius un informe detallado de los hallazgos galileanos. .